【摘要】  目的：探討建立一種肝硬化基礎(chǔ)上大鼠肝癌模型的方法。 方法：60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，按60 mL/L CCl4和100 mL/L食用白酒的方法誘導(dǎo)肝癌模型。 觀察兩組大鼠不同時(shí)期質(zhì)量變化，死亡率，肝假小葉形成率及肝癌結(jié)節(jié)發(fā)生率。 結(jié)果：誘導(dǎo)16 wk后， 對(duì)照組大鼠質(zhì)量明顯增加，無(wú)死亡，無(wú)肝硬化，無(wú)肝癌形成。 實(shí)驗(yàn)組大鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，2 wk后假小葉形成率90%，繼續(xù)誘導(dǎo)4 wk后癌結(jié)節(jié)形成率40%. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠的死亡率為10%. 結(jié)論：CCl4和食用白酒可成功誘導(dǎo)大鼠肝硬化模型，延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間可產(chǎn)生一定數(shù)量的肝癌模型。

　　0引言

　　肝硬化基礎(chǔ)上的肝癌在我國(guó)發(fā)病率比較高，也是一種常見(jiàn)及重要的死亡原因。建立一個(gè)類(lèi)似于人類(lèi)肝硬化基礎(chǔ)上肝癌的動(dòng)物模型是深入研究肝癌的不可缺少的環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)我們通過(guò)腹部皮下注射CCl4并用100 mL/L食用白酒代替飲用水復(fù)制大鼠肝硬化模型，通過(guò)延長(zhǎng)造模時(shí)間，來(lái)探討建立一種理想的肝硬化基礎(chǔ)上的肝癌動(dòng)物模型的方法。

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　純系SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，按清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，普通顆粒飼料喂養(yǎng)。 四氯化碳（分析純）購(gòu)自寧波市江東化學(xué)試劑廠（批號(hào)：9406661）。 橄欖油購(gòu)自上海衛(wèi)輝化學(xué)試劑廠（批號(hào)：930112）。 TD型電子天平（余姚市金諾天平有限公司）由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。顯微鏡（Olympus）由西安市鐵路中心醫(yī)院病理科提供。

　　1.2方法

　　將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成2組，每組30只。對(duì)照組：按3 μL/g體質(zhì)量給予橄欖油溶液腹壁皮下注射，2次/wk，普通飼料加清水喂養(yǎng)； 實(shí)驗(yàn)組大鼠按3 μL/g體質(zhì)量給予600 mL/L CCl4橄欖油溶液腹壁皮下注射，100 mL/L食用白酒溶液作為飲用水，普通顆粒飼料喂養(yǎng)16 wk.監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)期間大鼠體質(zhì)量變化、活動(dòng)及對(duì)外界的反應(yīng)情況，同時(shí)記錄大鼠死亡情況及死亡時(shí)間。 在造模的第4，8，12，和16 wk觀察兩組大鼠肝臟的大體及病理組織變化。

　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 采用t檢驗(yàn)， P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2結(jié)果

　　2.1大體觀察對(duì)照組大鼠毛發(fā)有光澤，精神狀態(tài)好， 活動(dòng)多，食欲佳，對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏， 實(shí)驗(yàn)組大鼠毛發(fā)凌亂， 無(wú)光澤，食欲差，精神萎靡， 活動(dòng)少，對(duì)外界刺激反應(yīng)慢。 對(duì)照組大鼠體質(zhì)量顯著增加，實(shí)驗(yàn)組大鼠實(shí)驗(yàn)過(guò)程中體質(zhì)量增加緩慢，尤以前期增長(zhǎng)更為緩慢。 第12周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組大鼠體重與對(duì)照組大鼠體質(zhì)重相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（286±12） g vs （398±16） g， P<0.01］。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)照組大鼠無(wú)死亡，實(shí)驗(yàn)組大鼠的死亡率為10%.

　　2.2肝臟組織學(xué)改變對(duì)照組大鼠肝臟紅潤(rùn)，鏡下細(xì)胞大小一致，細(xì)胞排列呈條索狀，以中央靜脈為中心呈放射狀，肝竇無(wú)狹窄，小葉及匯管區(qū)無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，表面光滑無(wú)結(jié)節(jié)，實(shí)驗(yàn)組大鼠誘導(dǎo)4 wk可見(jiàn)肝細(xì)胞變性、壞死，8 wk可見(jiàn)部分肝細(xì)胞變性和壞死，壞死以小葉周?chē)@著，匯管區(qū)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生，12 wk可見(jiàn)肝內(nèi)廣泛假小葉形成，假小葉內(nèi)可見(jiàn)纖維再分隔現(xiàn)象，現(xiàn)時(shí)伴有明顯的肝細(xì)胞再生結(jié)節(jié)，16 wk癌變肝組織可見(jiàn)癌巢形成，癌細(xì)胞具有多形性和明顯異型性呈多角型，核大，核仁明顯，并可見(jiàn)多核巨細(xì)胞（圖1）。

　　3討論

　　CCl4是最為常用的肝臟毒素，最早、最廣泛用于實(shí)驗(yàn)性肝纖維化研究［1-2］，其誘導(dǎo)慢性肝損傷的機(jī)理是：在肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，CCl4通過(guò)肝微粒體細(xì)胞色素氧化酶激活后，產(chǎn)生自由基CCl3及Cl. 還可攻擊膜不飽和脂質(zhì)，引發(fā)活性氧自由基的產(chǎn)生和脂質(zhì)過(guò)氧化，損傷肝細(xì)胞，從而導(dǎo)致狄氏間隙內(nèi)原本靜止的貯脂細(xì)胞活化，釋放Ⅳ型膠原酶，降解Ⅳ型膠原，肝細(xì)胞從合成分泌Ⅲ型膠原變?yōu)楹铣煞置贗型膠原，取代了Ⅳ型膠原，促使肝臟纖維化。 乙醇法誘導(dǎo)慢性肝損傷的機(jī)制是：乙醇進(jìn)入肝細(xì)胞線粒體三羧酸循環(huán)，脂肪酸氧化減少而合成增加，甘油三酯和脂肪酸在肝內(nèi)蓄積導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變。肝臟持續(xù)的炎癥反應(yīng)激活kupffer細(xì)胞，同時(shí)乙醇還可以直接損傷血管內(nèi)皮，甚至發(fā)展為肝硬化。此外， 乙醇可增強(qiáng)CCl4對(duì)肝細(xì)胞的毒性作用，因此CCl4與乙醇聯(lián)合應(yīng)用可促進(jìn)肝硬化的形成。金峰等［3］ 將SD大鼠分為兩組，實(shí)驗(yàn)組給予濃度逐漸增加的CCl4，并用食用白酒代替醫(yī)用乙醇溶液，對(duì)照組給予單純CCl4，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組9 wk內(nèi)死亡率為7.5％，對(duì)照組為17.5％；鏡下假小葉形成率實(shí)驗(yàn)組為90.0％，對(duì)照組為75.0％，并認(rèn)為適度提高CCl4的濃度并采用食用白酒代替醫(yī)用乙醇溶液誘導(dǎo)大鼠肝硬化模型的死亡率低，成模率高。 本實(shí)驗(yàn)在此研究基礎(chǔ)上，我們采用600 mL/L CCl4聯(lián)合100 mL/L乙醇方法誘導(dǎo)肝硬化， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組12 wk內(nèi)大鼠死亡率為10%， 假小葉形成率為90%， 并在此基礎(chǔ)上繼續(xù)給予相同條件誘導(dǎo)4 wk， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分大鼠癌結(jié)節(jié)形成，形成率為40%. 實(shí)驗(yàn)表明基于傳統(tǒng)的肝硬化造模方法，通過(guò)延長(zhǎng)造模時(shí)間可以對(duì)大鼠的肝臟持續(xù)產(chǎn)生損傷，這種損傷到一定程度可誘發(fā)癌變的發(fā)生，產(chǎn)生一定數(shù)量的肝癌模型。

　　綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功地制備了大鼠肝硬化基礎(chǔ)上的肝癌模型，并在顯微鏡下觀察到了大鼠的肝硬化結(jié)節(jié)形成及鏡下癌結(jié)節(jié)、癌細(xì)胞形成，為以后研究肝癌打下了基礎(chǔ)。